A mutagenezis egy vagy több mutáció indukciója egy genomban , pontosan és önként. Ezt a módszert a DNS , az RNS és a fehérjék szerkezetének módosítására használják . Ezt a molekuláris biológiai technikát Michael Smith dolgozta ki 1978-ban. Nyilvánvalóan a helyszíni mutagenezis ötlete felmerült benne egy beszélgetés során Clyde Hutchison - szal 1976-ban az angliai Cambridge Institute-ban, amikor oligonukleotidok a DNS-fragmensek tisztítására. Ez a nagy felfedezés 1993-ban kémiai Nobel-díjat kapott Karry Mullis- szal , a Polymerase Láncreakció feltalálójával .
A helyspecifikus mutagenezis módszerek a polimeráz láncreakción (PCR) alapulnak. A mutációkat oligonukleotid primerek alkalmazásával vezetjük be, amelyeket előzetesen szintetizálunk. Ezek a primerek komplementerek a vad típusú szekvenciával, kivéve a nukleotidokat, amelyeknek mutálódniuk kell. Valójában a PCR nem igényel szigorú komplementaritást a nukleotid primer és a cél DNS szekvencia között. A PCR reakció végén a mutációk bejutnak a termékekbe, és háromféle típusúak lehetnek:
1) Helyettesítések: egy vagy több nukleotidot ugyanannyi különböző nukleotid helyettesít.
2) Inszerciók: egy vagy több nukleotidot adunk a célszekvenciához.
3) Deléciók: egy vagy több nukleotidot eltávolítunk a szekvenciából.
A hely-irányított mutagenezis egyik első megközelítése az átfedés kiterjesztésén alapul. Komplementer primereket használunk átfedő végű DNS-fragmensek előállítására PCR-rel. Ezeket a fragmenseket egyesítjük, és hibridizációjuk lehetővé teszi az átfedő régió megnyúlását. A mutációkat specifikus módon a nukleotidok változásai vezetik be a primerek szekvenciájában.
A gyakorlatban két primerpárt használnak három PCR-reakció végrehajtására. Az 1. és 2. láncindító 5'-régiójában hordozza a mutációt, és kiegészítik egymást. A 3. és 4. primer határozza meg az amplifikálni kívánt cél DNS-t. Az első PCR-t a 2. és 3. primerrel hajtják végre, és lehetővé teszi a cél DNS bal részének amplifikálását, beleértve a mutált régiót is. Az 1. és 4. láncindítóval végrehajtott második PCR a cél DNS megfelelő részét hozza létre, beleértve a mutált régiót is. Tisztított, kevert és denaturált e két PCR terméke hibridizálódhat a mutáns régióval, amely közös számukra. A 3. és 4. oligonukleotidokat tartalmazó harmadik PCR ezután lehetővé teszi a teljes cél-DNS megszerzését a mutációval.
További fontos megközelítések közé tartozik a helymeghatározott mutagenezis a QuickChange vektoron.
Számos technika lehetséges a PCR révén :