Az immunfluoreszcencia az immunfestés technikája , amely antitesteket , valamint fluorokrómokat használ . Az immunfluoreszcencia lehetővé teszi egy specifikus fehérje feltárását közvetlenül a sejtben, fluoreszcencia emisszióval . Ezért lehetővé teszi nemcsak a fehérje jelenlétének vagy hiányának meghatározását, hanem a sejtben vagy az elemzett szövetben való elhelyezkedését is.
A fluoreszcencia jelenséget a XIX . Század közepén fedezte fel Sir George Gabriel Stokes angol tudós . Ő volt az első, aki megfigyelte, hogy a fluorit , egy ásványi anyag fluoreszkál, ha ultraibolya sugárzásnak van kitéve , és a fluoreszcencia nevet adta neki.
Az első immunfluoreszcenciát használó munka az 1950-es évekig nyúlik vissza, amikor az antitesteket konjugálták kémiai jellegű fluorokrómokkal, például fluoreszceinnel .
Az első fluoreszcens fehérjéket (hasonlóan az immunfluoreszcenciában használt fluorokrómokhoz) jóval később fedezték fel, a GFP-vel ( Green Fluorescent Protein ) az 1960-as években Osamu Shimomura és Roger Y. Tsien . A medúza ( Aequorea victoria ) származéka, ennek a fehérjének a felfedezése 2008-ban kémiai Nobel-díjat nyert nekik . Manapság az immunfluoreszcenciában használt számos fluorokróm a GFP származéka.
Kétféle fluoreszcencia létezik. Mindenekelőtt az úgynevezett „természetes” fluoreszcencia vagy auto-fluoreszcencia, amelyet a sejt spontán bocsát ki. Megemlíthetjük például a növényi sejtek klorofillját. Ezután következik a fluorokróm, egy kémiai anyag által kibocsátott fluoreszcencia, amely fényt bocsát ki, ha egy bizonyos hullámhosszon gerjesztjük.
Az immunfluoreszcenciában kétféle jelölés végezhető. Az első a közvetlen immunfluoreszcencia. E jelölés során a kívánt molekula ellen irányított antitestet, az úgynevezett antigént használjuk. Ez az antitest fluorokrómhoz kapcsolódik. Ezután a készítmény feltárásához használhatunk epifluoreszcens mikroszkópot vagy konfokális mikroszkópot. Ez a technika továbbra is az egyik leggyakrabban használt tudományos kutatás.
Az indirekt immunfluoreszcencia (IFI) 2 antitest egymás utáni alkalmazásán alapul: az első monoklonális típusú antitest specifikusan felismeri a kérdéses fehérjét. A második poliklonális típusú antitest az elsődleges antitest ellen irányul (az első).
Ez a második jelölés. Ebben az esetben két antitestünk van. Az elsődleges antitest a kívánt antigén ellen irányul. Ezután egy második antitestet használunk, amelyet fluorokrómmal jelölünk, és amely nagy affinitással rendelkezik az elsődleges antitest iránt (az elsődleges antitest izotípusa ellen irányul, akkor ez egy antiglobulin) .
Előnyként lehetőség van több címkézésre ugyanazon cellamintán, ennek a módszernek a sebessége és könnyű kezelhetősége, valamint jó megbízhatósága. Ezenkívül a közvetett immunfluoreszcenciában a fényintenzitás növekszik, mivel az elsődleges antitesteken több kötőhely található, ami lehetővé teszi, hogy több másodlagos antitest is kapcsolódjon hozzájuk.
De van néhány hátránya. Például a hamis pozitív vagy hamis negatív reakciók lehetősége, a fluoreszcencia mértékének szubjektív értékelése és a fotófehérítés jelensége. Ezen hátrányok kiküszöbölésére számos módszer létezik. Először is végezzen negatív kontrollt a közvetett immunfluoreszcencia szempontjából, vagyis csak a másodlagos (jelölt) antitesteket helyezze érintkezésbe az elemzendő mintával. Mosási lépés után, ha a negatív kontroll jó, nem szabadott volna fluoreszcenciát kibocsátania, mert a másodlagos antitestek nem tudtak megkötődni, ezért a mosási lépés után távoztak. Ezután a nagy felbontású és nagy érzékenységű kamera használata gyengíti a fényt és lehetővé teszi a felvétel kvantitatív vizsgálatát.
Bár az immunfluoreszcencia elve egyszerű, a gyakorlatban számos tényezőt figyelembe kell venni.
Három területet különböztethetünk meg:
Az immunfluoreszcenciát a tenyésztett sejteken (majd immunocitokémiáról fogunk beszélni ) vagy a szövetszakaszokon ( immunhisztokémia ) alkalmazzák.