Spektrofotométer

A spektrofotométer egy spektrofotometrikus mérés végrehajtására szolgáló eszköz . A spektrométer , vagy spektroszkóp , egy olyan eszköz, amely lehetővé teszi, hogy végre egy spektrometriás mérés az abszorbanciát egy oldatot egy adott hullámhosszon , vagy egy adott régióban a spektrum .

Elv

Szerint a Beer-Lambert-törvény , az abszorbanciát egy oldat arányos az anyagok koncentrációjának az oldatban, feltéve, hogy az a hullámhosszon, amelyen az anyag elnyeli fénysugarak. Ezért állítják be a hullámhosszat annak az anyagnak megfelelően, amelynek koncentrációját meg akarjuk ismerni.

• A Beer-Lambert-törvény szerint az abszorbancia az oldat C koncentrációjának, a moláris abszorpciós együtthatónak és az oldat L-n áthaladó hosszának a függvénye.NÁL NÉLλ{\ displaystyle A _ {\ lambda}}ελ{\ displaystyle \ varepsilon _ {\ lambda}}

NÁL NÉLλ=-napló10.⁡énén0=ελ⋅ℓ⋅VS{\ displaystyle A _ {\ lambda} = - \ log _ {10} {\ frac {I} {I_ {0}}} = \ varepsilon _ {\ lambda} \ cdot \ ell \ cdot C}hol van az oldat áteresztőképessége.énén0{\ displaystyle {\ frac {I} {I_ {0}}}}

• Vegye figyelembe, hogy és az üzemi hullámhossz függvénye, az abszorpciós spektrumok függvényében választják meg.NÁL NÉLλ{\ displaystyle A _ {\ lambda}}ελ{\ displaystyle \ varepsilon _ {\ lambda}}

Itt a két spektrum egymásra épül, független elérésük érdekében megmértük egy NAD + (illetve NADH, H + ) oldat abszorbanciáját különböző hullámhosszakon (minden más dolog egyenlő).

A maximális abszorbancia hullámhossz itt = két nm = 260  nm . Ezért előnyösebb ezen a hullámhosszon dolgozni. Másrészt, ha NADH, H + -ot akarunk vizsgálni egy enzimatikus reakció során, ahol a NAD + például NADH-ra, H + -ra redukálódik , akkor ésszerűbb = 340  nm-en dolgozni, mert itt csak a NADH, H + értéket mérjük. mert a NAD + abszorbanciája akkor is nulla, ha jelen van a keverékben. λ{\ displaystyle \ lambda}λ{\ displaystyle \ lambda}

Infravörös (IR) spektrométereket használnak főleg az azonosításhoz. Elmondható, hogy a gyakorlatban UV-látható spektrométereket használnak kvantitatív elemzésekhez, míg az IR-spektrométereket kvalitatív eszközöknek. Mindkettő hasonló optikai elveket alkalmaz, de az IR spektrométer frekvenciája beolvassa a mintát.

Képtár:

• Laboratóriumi spektrométer (fedél nyitva).

• Laboratóriumi spektrométer (zárt).

• Egy másik modell.

• Kézi spektrométer a felület színének (gyakran az L * a * b * rendszerben kifejezve) mérésére .

Az UV-látható spektrométer (UV: ultraibolya) a következőket tartalmazza:

• fényforrás vagy fényforrások  : fehér fény a látható spektrumban ( polikromatikus fény ) és / vagy UV fény mérésére .
  • Az UV-lámpa általában deutérium típusú (például 195–380  nm tartomány , lámpa élettartama például 1000  óra ).
  • A látható lámpa általában halogén típusú (például 320 és 1000  nm közötti tartomány , például 500  óra élettartam ).
  • Vannak xenonlámpás spektrométerek is; (190 és 1100  nm közötti tartomány )
• Egy monokromátor által alkotott hálózat diffrakciós fény a forrásból. Lehetővé teszi a fény hullámhosszának kiválasztását, amely áthalad a vizsgálandó oldaton;
• rögzített vagy változtatható szélességű rés a sávszélesség beállításához;
• egy küvettatartó, amely lehetővé teszi az oldat elemzésének a kívánt hőmérsékleten tartását, ezt a hőmérsékletet vízkör vagy Peltier-effektus tartja fenn . Ez a rögzített hőmérsékleten tartás nagyon hasznos az enzimatikus kinetika mérésekor , valójában a reakció sebessége a hőmérséklettől függ;
• egy átlátszó küvettát , hogy az oldatot a vizsgálandó helyezzük. A minta minőségétől és mennyiségétől függően különböző küvetták vannak, általában műanyag (látható spektrum, UV közelében) vagy kvarc (UV, de nagyon drága küvetta).

Az oldószer és az alkalmazott reagens (ek) nem mindig átlátszóak, kötelező egy "vak" vagy kompenzációs indikátort, vagyis az eszköz (tára) nullázását végrehajtani, csak az oldószer és a reagens ( s) a küvettában, a mintát tartalmazó küvetta mérése előtt, minden vizsgált hullámhosszra.
A kutatási tervek általában kétnyalábúak, és két küvettát használnak, az oldószert és reagens (ek) et tartalmazó referenciaküvettát, valamint a mintát tartalmazó küvettát (oldószerrel és reagenssel). A referencia küvettában lévő folyadékot ezután automatikusan levonják (automatikus nulla funkció);

• egy fotoelektromos cella , amely visszaállítja az áramot a beérkező fotonok számával arányosan . A legújabb modelleknél az egyetlen fotodióda típusú detektort néha CCD- tömb vagy dióda-tömb helyettesíti (minden érzékeny cella fix színt kap). A legérzékenyebb modellek fényszorzót vagy PMT típusú detektort használnak;
• egy elektronikus detektor, amelynek válasza arányos ezzel az elektromos árammal, és lehetővé teszi a fényintenzitás relatív mérését.

A spektrometriát elsősorban a festékoldat koncentrációjának meghatározására használják (a folyamatot kolorimetriás vizsgálatnak nevezik ).

Alkalmazási területek

A biológiában

• A spektrométert az MTT teszt végrehajtásakor használják .
• A molekuláris biológiában a DNS kivonása során alkalmazzák a DNS számszerűsítésére és tisztaságának meghatározására. A 260  nm hullámhosszt alkalmazzuk, amely a nukleinsavak maximális abszorpciójának területe. Egy második mérés 280  nm-en lehetővé teszi az extrakció tisztaságának ellenőrzését, nevezetesen a maradék fehérjék jelenlétét a DNS-oldatban.

Tisztított DNS-oldat esetén az R aránynak 1,8 és 2 között kell lennie. Ha R szignifikánsan kisebb, mint 1,8, akkor valószínűleg a fehérjék szennyezik az oldatot. 2-nél nagyobb, ez az arány valószínű RNS-szennyezést jelez.

R = (A 260 - A 320 ) / (A 280 - A 320 ) R leegyszerűsödik, ha (gyakori eset) A 320 = 0.

A DNS-koncentráció kiszámítható a 260  nm-en mért korrelációs tényező segítségével:

• Kétszálú DNS: 1 Abs = 50 ng / µl
• Egyszálú DNS: 33 ng / µl (mint az egyszálú RNS)
• RNS: 1 Abs = 40 ng / ul.

A biokémiában a fehérjék tisztítása során számszerűsítik őket ( 280  nm hullámhossz ) és tisztaságuk szintjét ( 260  nm hullámhossz ).

Az orvostudományban

Különböző vérenzimek kinetikai elemzése, lúgos foszfatáz: kolesztáz, laktát-dehidrogenáz meghatározása: miokardiális infarktus, hemolízis.

A fizikában

A fény elemzése lehetővé teszi a fénykibocsátást okozó kémiai komponensek meghatározását: például a csillagok kémiai összetételét.

A kémia területén

Az oldatok abszorpciójának elemzése egy adott hullámhosszon lehetővé teszi ezen oldatok adagolását a Beer-Lambert törvény szerint (a koncentráció arányos a fényabszorpció logaritmusával). Ezért közvetlen összefüggés van az elnyelt fény mennyisége és a kémiai vegyület koncentrációja között az oldatban. Az időbeli abszorpció monitorozása a kémiai reakciók (kinetika) sebességének jellemzésére szolgáló módszer.

A frekvenciasöprés lehetővé teszi az oldatban jelen lévő fajok jellemzését azáltal, hogy visszatér a figyelembe vett energiaátmenet jellegéhez.

A grafikai iparban

A színek mérésére szolgál a kimeneti eszközök, például a plotterek kalibrálása érdekében .

Bibliográfia

• Georges Bruhat , Optique , hatodik kiadás, referencia tanfolyamok gyűjteménye, Dunod, 2005, 1152 p.

Lásd is

• Spektrofotometria
• spektrometria

Megjegyzések és hivatkozások

1. Vö. G. Bruhat (2005), Optika , hatodik kiadás, Dunod: § Spektrofotometria.
2. A moláris abszorpciós együtthatóhoz általában használt egységgel való homogenitás alapján a hosszt cm-ben fejezzük ki. Ezért a küvetták többségét L = 1  cm-re szabványosítják .