A DNS-szekvenálásnak meg kell határoznia a nukleotidok sorrendjét az adott DNS- fragmenshez .
A DNS-szekvencia tartalmazza azokat az információkat, amelyekre az élőlényeknek szüksége van a túléléshez és a szaporodáshoz. Ennek a sorrendnek a meghatározása ezért hasznos mind az organizmusok életmódjának megismerésére irányuló kutatások, mind az alkalmazott alanyok számára. Az orvostudományban fel lehet használni a genetikai betegségek és a virológia azonosítására, diagnosztizálására és potenciális kezelésére . A biológiában a DNS-szekvenciák vizsgálata fontos eszközzé vált a fajok osztályozásában .
A DNS-szekvenálást az 1970-es évek második felében találták ki. Két módszert fejlesztettek ki egymástól függetlenül, egyet Walter Gilbert csapata az Egyesült Államokban , a másikat Frederick Sanger (1977-ben), az Egyesült Királyságban . Ez a két módszer teljesen ellentétes elveken alapszik: a Sanger-módszer szelektív enzimatikus szintézissel , míg Maxam és Gilbert módszer szelektív kémiai lebontással . Erre a felfedezésre Gilbert és Sanger 1980 -ban kémiai Nobel-díjat kapott .
Kezdetben Sanger-módszer megkövetelte az egyszálú DNS rendelkezésre állását, amely templátként szolgált a komplementer szál enzimatikus szintéziséhez. Emiatt az első biológiai szervezet, amelynek genomját 1977-ben szekvenálták, a φX174 bakteriofág vírus . Ennek a vírusnak az a tulajdonsága, hogy a genom egyszálú DNS-ből áll, amely a vírusrészecskébe van kapszulázva.
Az elmúlt 25 évben a Sanger-módszert számos fontos technológiai fejlődésnek köszönhetően széles körben fejlesztették:
Maxam és Gilbert módszere mérgező kémiai reagenseket igényel, és korlátozott marad az elemezhető DNS-fragmensek nagysága szempontjából (<250 nukleotid). Kevésbé egyszerű robotizálni, használata mára bizalmas jellegűvé vált.
Ezt a módszert hagyományosan kis pontok szekvenálásának végrehajtására használják. A teljes genom szekvenálásához a következő generációs szekvenálást használják. Ennek a módszernek az az eleme, hogy megindítjuk a DNS polimerizációját egy kis oligonukleotid (primer) alkalmazásával, amely komplementer a szekvenálandó DNS fragmens egy részével. A primer meghosszabbítását a Klenow-fragmens hajtja végre (egy I DNS-polimeráz, amely nem rendelkezik 5 '→ 3' exonukleázaktivitással), és hőstabilis DNS-polimerázokkal tartják fenn , amelyeket a PCR-hez használnak . Hozzáadjuk a négy dezoxiribonukleotidot (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), valamint a négy dideoxiribonukleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP vagy ddTTP) egyikének alacsony koncentrációját.
Ezek a dideoxiribonukleotidok láncterminátor "mérgekként" működnek: miután beépültek az új szintetizált szálba, megakadályozzák a további megnyúlást, mert nincs 3'-OH végük (a hidroxil helyett csak hidrogén van). Ez a végződés specifikusan a reakcióba beépített dideoxiribonukleotidnak megfelelő nukleotidok szintjén megy végbe. Ugyanazon DNS-fragmens teljes szekvenálásához ezt a reakciót négyszer, párhuzamosan megismételjük a négy különböző dideoxiribonukleotiddal.
Például abban a reakcióban, ahol ddGTP-t adtak hozzá, a szintézis G szintnél leáll. A dGTP-t és egy kevés ddGTP-t egyaránt tartalmazó reakcióelegy statisztikailag attól függően következik be, hogy a DNS-polimeráz használja-e ezen nukleotidok egyikét is. Ennek eredményeként egyre nagyobb méretű DNS-fragmensek keverednek, amelyek mindegyike a szekvencia egyik G-jénél végződik. Ezeket a fragmenseket ezután elektroforézissel elválasztjuk egy poliakrilamid gélen , ami így lehetővé teszi a G-k helyzetének azonosítását a szekvenciában.
Az így szintetizált fragmenseket egy nyomjelző beépítésével detektálják a szintetizált DNS-be. Kezdetben ez a nyomjelző radioaktív volt; ma fluoreszcens jelzőket alkalmaznak, amelyek vagy az oligonukleotidhoz, vagy a dideoxi -ribonukleotidhoz kapcsolódnak.
Ez a módszer a DNS kémiai lebontásán alapul, és a négy A, T, G és C bázis különböző reakcióképességét használja fel a szelektív hasítások elérésére. A vágások sorrendjének rekonstrukciójával visszatérhetünk a megfelelő DNS nukleotidszekvenciájához . Ez a kémiai szekvenálás hat egymást követő szakaszra bontható:
A genom teljes szerkezetének ismerete átmehet szekvenciáján. Mivel azonban a genomok nagysága több millió bázis (vagy megabázis), a molekuláris biológiai megközelítéseket össze kell kapcsolni a számítástechnikával, hogy ilyen nagyszámú adat feldolgozható legyen.
A teljes genomszekvenálás két fő elvét alkalmazzák. Mindkét esetben a genomi DNS- t először enzimatikus ( restrikciós enzimek ) vagy fizikai ( ultrahang ) módszerekkel fragmentálják :
A fő különbség e két elv között az, hogy a hierarchikus szekvenálás megpróbálja összehangolni egy nagy klónkészletet (~ 100 kb), míg a teljes módszerben az egész genom apró fragmentumokká redukálódik, amelyeket szekvenálnak, majd összehangolnak.
Az extrakció után a genomi DNS-t szonikálással 50–200 kb méretű fragmensekre vágjuk, majd megfelelő vektorba , például bakteriális mesterséges kromoszómákba vagy BAC- ba klónozzuk . A klónok számának lehetővé kell tennie a vizsgált genom teljes hosszának 5-10-szeres lefedettségét. A klónok átfedését és sorrendjét vagy specifikus próbák hibridizálásával , vagy a restrikciós profilok elemzésével , vagy gyakrabban a BAC végeinek szekvenálása és hibridizálása utáni rendezéssel végezzük. A klónok rendezése után szétaprózzák és szekvenálják őket, majd bioinformatikai összehangolással állítják össze.
Ennek a módszernek az az előnye, hogy a töredékek összeszerelése könnyebb a BAC-ok átfedésének köszönhetően, a fragmentumok összehasonlítása a rendelkezésre álló adatbázisokkal, valamint a szekvenálási munka megosztása több laboratórium között, amelyek mindegyike felelős kromoszóma régió.
A fő hátrány az, hogy bizonyos genomokban, például emlősökben nagyon gyakran előforduló, ismételt szekvenciákat tartalmazó fragmenseket klónozni kell, ami megnehezíti a végső bioinformatikai elemzést.
Ez egy genomiális DNS- szekvenálási módszer, amelyet eredetileg Frederick Sanger cambridge-i laboratóriumában dolgoztak ki az 1970-es évek végén a vírusok első genomjának szekvenálására.
Ezt a módszert Craig Venter népszerűsítette nagy genomok szekvenálására, különösen a Celera Genomics cégen belül . Az első alkalmazás a baktériumok, majd a Drosophila genom szekvenálása volt, végül pedig az emberi és az egér genom szekvenálása . A teljes genomszekvenálás elvégzéséhez ezzel a technikával két-három könyvtárat készítenek, amelyek genomi DNS véletlenszerű fragmentumaiból állnak. A könyvtárak között a töredékek mind méretükben, mind lokalizációjukban eltérnek a genomtól . Ezekből a könyvtárakból sok klónt szekvenálunk, majd összeállítunk. A teljes szekvenciát úgy kapjuk meg, hogy az összes könyvtárat feldolgozzuk bioinformatikai eszközökkel, és a fragmenseket az átfedő szekvenciák segítségével igazítjuk.
A hierarchikus szekvenálással történő szekvenálás előnyei a technika gyorsasága és az alacsonyabb költségek. Hátránya, hogy a számítógépes feldolgozás nem teszi lehetővé az ismétlődő nagy szekvenciákat tartalmazó fragmensek egymáshoz igazítását, amelyek gyakran vannak jelen az emlősök genomjában .
Ezt a módszert általában puskának (fűrészelt puskának) vagy Whole Genome Shotgunnak (WGS) nevezik . Ez a metafora szemlélteti a genomi DNS kezdeti fragmentációjának véletlenszerű jellegét: a teljes genomot permetezik, kissé úgy, mintha az ilyen típusú lőfegyverek pelletei szétszóródnának.
A hibridizációval végzett szekvenálás több száz (az első generációs chipekhez) és több ezer oligonukleotidot tartalmazó DNS-chipek használatán alapul . Az elemzendő DNS-t több fragmensre vágjuk, majd inkubáljuk a chipen, ahol hibridizálódnak azokkal az oligonukleotidokkal, amelyekkel komplementerek. A chip elolvasása (hibridizált oligonukleotidok kimutatása) lehetővé teszi a DNS-szekvencia spektrumának megszerzését , vagyis annak összetételét n nukleotid szekvenciájában , ahol n az alkalmazott chip próbáinak mérete. Ezután a spektrum számítógépes feldolgozása lehetővé teszi a teljes szekvencia helyreállítását.
Sanger technikájának adaptációja, amely radioaktivitás helyett fluoreszcenciát használ . A beépített dideoxinukleotidokat fluoreszcens molekulákkal vagy „ fluorokróm ” fluoroforokkal (ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTP-TAMRA és ddTTP-ROX) jelölik.
A szekvencia reakciót PCR-rel hajtjuk végre . A Taq-polimeráz megnyújtja a fluoreszcenciával jelzett dideoxinukleotid beépülését. A szintetizált fragmenseket ezután elektroforézissel elválasztjuk .
Egy automatikus eszköz felveszi a szekvencia reakciót, és egy poliakrilamid- polimert tartalmazó kapillárisba injektálja . A migráció során egy lézer optikai rendszer érzékeli a lézerablak előtt áthaladó fluoreszcenciát, amelyet a gerjesztés alatt álló fragmens ddNTP terminátora bocsát ki (zöld fény a JOE „ddATP”, kék az 5-FAM „ddCTP”, sárga az TAMRA "ddGTP" és piros a ROX "ddTTP" esetén.
Ha ezeket a molekulákat méretük szerint elektroforézissel szétválasztjuk, elolvashatjuk az egymást követő betűket, amelyek görbék formájában jelennek meg egy elektroferogramon (vagy fluorogramon ), amelynek fluoreszcenciája megfelel ennek a végződő ddNTP-nek a bázisának. Az elemző szoftver lehetővé teszi a fluoreszcencia görbék és a beépített nukleotid közötti megfeleltetést.
Az információkat elektronikus úton rögzítik, és az értelmezett sorrendet a számítógép adatbázisában tárolják . Ez a fajta szekvenálás állítólag nagy áteresztőképességű, mivel sok szekvencia hajtható végre egyszerre. Valójában, a szekvenszer modelljétől függően 1, 6, 12 vagy akár 36 kapilláris működhet párhuzamosan, tudva, hogy az automatika egymás után 96 lemezes szekvenciareakciót tud injektálni az egyes kapillárisokba. A lejátszás hossza kb. 1 kb sorozatonként. Egy sorozat futtatásának ideje körülbelül 10 perc. Egy éjszaka alatt, 12 kapilláris mellett a szekvenszer automatikusan megszerzi az 1 Mb értéket.
A következő generációs szekvenálási módszerek összehasonlításaMódszer | Olvasási hossz | pontosság | Olvasás tapasztalat alapján | tapasztalati idő | 1 millió bázis költsége (USA dollárban) | Előnyök | Hátrányok |
---|---|---|---|---|---|---|---|
Valós idejű egyetlen molekula szekvenálás (Pacific Biosciences) | Átlagosan 10 000 bp és 15 000 bp (14 000 bp N50); maximális olvasási hossz> 40 000 bázis | 87% | Cellánként 50 000, vagyis 500–1000 megabázis | 30 perc és 4 óra között | 0,13–0,60 USD | hosszú olvasmányok. Gyors. 4mC, 5mC, 6mA detektál | mérsékelt áramlás, a berendezés nagyon drága lehet |
Ion félvezető ( Ion Torrent szekvenálása ) | 400 bp-ig | 98% | akár 80 millió | 2 óra | 1 USD | a legolcsóbb, gyors felszerelés | homopolimer hibák |
Piroszekvenálás ( 454 ) | 700 bp | 99,9% | 1 millió | 24 óra | 10 USD | hosszú, gyorsan olvasható | a kísérlet drága, homopolimer hibák |
Szintézis szekvenálás (Illumina) | 50-300 bp | 99,9% | legfeljebb 6 milliárd | 1-11 napig | 0,05–0,15 USD | Nagy szekvencia átviteli potenciál, a szekvenszer modelljétől és a kívánt alkalmazástól függően | A berendezések nagyon drágák lehetnek. Nagy DNS-koncentrációt igényel. |
Ligációs szekvenálás (SOLiD szekvenálás) | 50 + 35 vagy 50 + 50 bp | 99,9% | N / A | 20 perc és 3 óra között | 2400 USD | hosszú olvasmányok. Hasznos sok alkalmazáshoz. | Drágább és kényelmetlenebb a nagy szekvenálási projekteknél. Ez a módszer a plazmid klónozásához vagy a PCR lépéshez is időt igényel. |
Vezetéknév | Gépek száma (világszerte) |
---|---|
Illumina HiSeq 2000 | 5490 |
Illumina Genome Analyzer 2x | 411 |
454. szikla | 382 |
ABI SOLiD | 326 |
Ion Torrent | 301 |
Illumina MiSeq | 299 |
Ion Proton | 104 |
Csendes-óceáni biológiai tudományok | 50 |
Oxford Nanopore MinION | 14 |
Illumina NextSeq | 3 |
A nanopórus-szekvenálás 1995 óta fejlesztés alatt álló módszer a DNS-szekvenálásra.
A nanopórus egyszerűen egy kis lyuk, amelynek belső átmérője 1 nanométer nagyságrendű. Néhány porózus transzmembrán sejtfehérje nanohuzalként viselkedik, nanopórusokat is készítettek egy kissé nagyobb lyuk (több tíz nanométer) marásával egy szilíciumdarabba.
A nanorész-szekvenálás mögött álló elmélet a következő: Ha egy nanorészecskét egy vezető folyadékba merítünk, és potenciál (feszültség) kerül rá, akkor az ionok nanopóruson keresztül történő vezetése miatt elektromos áram figyelhető meg. Az áram mennyisége nagyon érzékeny a nanopórus méretére és alakjára. Ha egyes nukleotidok (bázisok), DNS-szálak vagy más molekulák áthaladnak a nanopóruson vagy annak közelében, ez jellegzetes változást hozhat létre a nanopóruson átáramló áram nagyságában.
A XX . Század második felének elején az emberi gyógyszer arányát továbbra is a betegségek megértésének és kezelésének akarata, valamint a szervezetet fenyegető különféle fenyegetések dominálták. A működésének megértése azonban az elmúlt évtizedekben nagymértékben elmélyült, különösen a különböző technikák fejlesztésének és megjelenésének köszönhetően. Magát az egészség fogalmát, ami akkor inkább a patológia hiányát jelentette, természetesen újradefiniálták, hogy ezentúl inkább az egyén testi és erkölcsi általános jólétének érzését jelentse. Így az új kereskedelmi stratégiák demokratizálódtak, hogy minden egyes ember számára lehetőséget biztosítson a saját testi épségének gondozására. (vény nélkül kapható gyógyszerek, egészséges ételek stb.).
A DNS-szekvenálás az egészség fogalmának és általában az „élőlényekkel” való kapcsolat újradefiniálásának központi eleme, mivel optimális és személyre szabott kezelést javasol minden ember számára. A genetikai adatok piaca nagyon gyorsan fejlődött, és létrehozása óta számos beruházás az árak nagyon hirtelen csökkenéséhez vezetett.
Az emberi genom első teljes szekvenálása 2003-ban fejeződött be, és körülbelül tíz évig tartott, összesen 2,7 milliárd dolláros beruházással. Abban az időben a Sanger-módszert még mindig erősen alkalmazták a DNS-t alkotó mintegy 3 milliárd nukleotidpár megfejtésére. Ezután számos projekt jelent meg (különösen 1000 Génomes , ENCODE …), és új gépeket fejlesztettek ki (a fentiekben említettek), amelyek célja az emberi genom teljes szekvenciájának előállítása kevesebb, mint 1000 dollárért. A szekvenálási módszerek fejlesztésével az emberi genom kiváló minőségű részleges szekvenálásának árát 2006-ban 14 millió dollárra becsülték, ami viszonylag olcsóbb a 2003-ban befejezett projekthez képest. 2015 végén a egyetlen sorozat 1500 dollár körül volt.
Ezen új, sokkal hatékonyabb módszerek megjelenésével, amelyek az NGS rövidítés alatt csoportosulnak , gyorsabbak és olcsóbbak, a DNS-szekvenálási piac felrobbant, és számos alkalmazás elérhető ma különböző területeken. Néhány vállalat, mint például az Illumina, most DNS-szekvenálási szolgáltatást kínál, amely az egyének számára pénzügyileg elérhető.
A DNS- szekvenálás felhasználható bármely szervezet egyedi génjeinek, nagy genetikai régióinak, teljes kromoszómáinak vagy teljes genomjainak szekvenciájának meghatározására. A DNS-szekvenálás kulcsfontosságú technológiává vált a biológia és más tudományok számos területén, például az orvostudományban, a törvényszéken vagy az antropológiában .
A molekuláris biológiában a genomszekvenálás lehetővé teszi a kódolt fehérjék tanulmányozását , a kutatók azonosítják a gének változását és egyes betegségekhez társítják a potenciális gyógyszerek célzását.
A szekvenálás lehetővé tette bizonyos rákok genetikai eredetének megértését , amelyek a mutációk felhalmozódása miatt keletkeznek a kritikus génekben, amelyek módosítják a sejtszaporodás, a differenciálódás és a halál normális programját. A RAS-RAF-MEK-ERK-MAP kináz magában foglalja a növekedési szignálokra adott sejtreakciókat, és az emberi rák körülbelül 15% -ában a RAS gén mutálódik, ami onkogén formát okoz.
Mivel a DNS informatív makromolekula a nemzedékről nemzedékre történő átvitel szempontjából, a paleogenetikusok és az antropológusok közötti együttműködésen alapuló vizsgálatok alapján az evolúciós biológiában a DNS-szekvenálást használják az evolúciós biológiában. A nekropoliszokba temetett emberi szövetek, főleg csont és fogak DNS-ének elemzése lehetővé teszi a haplocsoportok meghatározását és azok biogeográfiai eredetének, valamint a vándorlási útvonalak megbecsülését, amelyeket száz vagy ezer évvel ezelőtt megtehettek volna, összehasonlítás céljából genetikai jellemzőik és a jelenlegi populációk jellemzői, vagy bizonyos fizikai tulajdonságaik megállapításához. A genomszekvenálás árának esése miatt a vállalatok felajánlják, hogy a lakosság fizető szolgáltatásként felkutatja az ember származását egy egyszerű, otthon használható készletből.
Az orvosi genetikusok szekvenálhatják a betegek génjeit, hogy megállapítsák, fennáll-e a genetikai betegségek kockázata. Ez a személy genetikai jellemzőinek vizsgálata. A diagnózis tipikusan pre- vagy post-natal. Például a prenatális diagnózis felismerheti a súlyos fogyatékosságért, illetve viselkedési és pszichológiai rendellenességekért felelős örökletes betegséget, és lehetőséget adhat azoknak a szülőknek a választására, akiknek gyermekét diagnosztizálták, hogy folytatják-e a terhességet vagy sem. A genetikai variációkra ( egy nukleotid polimorfizmusokra ) vonatkozó információk szintén irányítják a terápiás kezelést, és genetikai tanácsadást tesznek lehetővé a családtagok számára.
A genetikai jellemzők vizsgálatát egyre nagyobb teljesítményű DNS-szekvenálás (NGS) végzi. Jelenleg általában csak a gének kódoló részei vannak szekvenálva , amelyekben a mutációk 2/3-át írják le. Az NGS ezért lehetővé teszi az ember génjeinek összes kódoló részének egyszeri szekvenálását , amelyet exomnak nevezünk .
A prenatális diagnózis során a DPNI-t biztonságos és korai felismerési technikaként alkalmazzák Down-szindróma vagy más kromoszóma-rendellenességek, vagy akár bizonyos pontmutációk esetén. Ez nem diagnózis, hanem csak szűrés. Ez abból áll, hogy terhesség alatt vért vesznek az anyától. Ez a vér természetesen kis mennyiségű DNS-fragmenst tartalmaz a magzatból, és a genetikusok nem tudják elválasztani az anyához tartozó DNS-fragmensektől, amelyek szintén megtalálhatók a vérben. A DPNI tehát az anya vérében keringő összes DNS-fragmens nagy áteresztőképességű szekvenálása, majd az eredmények számítógépes elemzése. A DPNI a non-invazív technikával végzett prenatális szűrést jelenti. Az eredményektől függően fel kell tüntetni a rendellenesség megerősítését, amely magzatvizeléssel jár .
A reproduktív orvoslás az orvostudomány azon ága, amely a szaporodás fiziológiáját, valamint annak patológiáját, meddőségét tanulmányozza. Az orvoslás ezen megközelítése a reproduktív egészség javítását célozza.
A DNS-szekvenálás, különösen a nemi sejtek számára, lehetővé tette a termékenység egyensúlyhiányát okozó genetikai módosítások megértését. A jövőbeni genetikai kezeléseket az örökletes betegségek megelőzésére tervezik, például a 21-es triszómia annak a génnek az expressziója, amely az X-kromoszóma inaktiválásáért felelős a megtermékenyítés során. Ugyanakkor bioetikai kérdések merülnek fel a DNS utódnemzés céljából történő feldolgozásával kapcsolatban.
A nagy áteresztőképességű szekvenálás az orvosi mikrobiológia területére is bekerült. Például a bakteriológiában, még ha ugyanazok a baktériumfajok (pl. Staphylococcus aureus ) is megtalálhatók két, különféle betegekből származó mintában, ez nem feltétlenül jelenti a betegről a betegre történő közvetlen átvitelét. Valójában ugyanazok a baktériumfajok nagyon sok különböző törzset csoportosítanak, és így különböző a genomjuk. A teljes genomszekvenálás lehetővé teszi például annak megállapítását, hogy ezek a genomok mennyire különböznek azáltal, hogy mennyiségileg meghatározzuk az organizmusok közötti mutációk ( SNP ) számát . A baktériumok egyik betegből a másikba történő közvetlen átvitelénél a differenciális mutációk száma ezért nagyon alacsony.
Összességében a teljes baktériumgenomok nagy áteresztőképességű szekvenálása hasznos lehet:
Egy személy DNS-e tárgyakkal vagy emberekkel való érintkezés útján átvihető. Ez a DNS különböző mátrixok sejtjeiből származik, vérből, spermiumokból, szőr elemekből, hámsejtekből. (A DNS-szekvenálás a DNS-profilalkotási módszerekkel használható a törvényszéki azonosításra és az apaság vizsgálatára. Meg kell azonban jegyezni, hogy az apasági tesztnek Franciaországban nincs jogi értéke. Csak akkor, ha azt bíró rendelte el.