Először 2009-ben írták le, hogy a transzkripciós aktivátor-szerű effektor nukleázok (TALEN- ek , transzkripciós aktivátor-szerű effektor nukleázok ) egy mesterséges restrikciós enzimek , amelyeket egy DNS-kötő domén , TALE nevű fúzióval hoznak létre, egy olyan doménnel, amely képes hasítani a DNS-t .
A restrikciós enzimek olyan enzimek, amelyek képesek egy meghatározott szekvencián levágni a DNS-t. A transzkripciós aktivátor-szerű effektorok (Tales, transzkripciós aktivátor-szerű effektorok) gyorsan megtervezhetők, hogy gyakorlatilag bármely kívánt DNS-szekvenciához kapcsolódjanak. Ha egy TALE domént és egy DNS hasítási domént kombinálunk (amely elvágja a DNS szálat), specifikus restrikciós enzimeket lehet létrehozni bármely DNS szekvenciához. Amikor ezek az enzimek bejutnak a sejtekbe, felhasználhatók a genom in situ módosítására .
A TAL effektor (TALE) a Xanthomonas baktérium által kiválasztott fehérje . A DNS-kötő domén 33 vagy 34 aminosav ismétléséből áll , a 12. és 13. aminosav kivételével. Ez a két aminosav erősen változó és erős összefüggést mutat a nukleotid- specifikus felismerésével . Ez az aminosavszekvencia és a DNS-felismerés közötti egyszerű kapcsolat lehetővé teszi a szekvencia-specifikus DNS-kötő domének létrehozását azáltal, hogy kiválasztjuk a megfelelő változó aminosavakat tartalmazó ismétlődő szegmensek együttesét.
A Fok1 endonukleáz nemspecifikus DNS-hasítási doménje felhasználható olyan hibrid nukleázok létrehozására, amelyek hatékonynak bizonyultak az élesztővizsgálatokban. Ezek a fehérjék növényi és állati sejtekben is aktívak. Az első vizsgálatokat a TALEN-eken a Fok1 eredeti doménjével végezték, de a legújabb megközelítések olyan mutációkat hordozó doméneket használnak, amelyeket kifejezetten a DNS hasításának specifitásának és hatékonyságának növelésére terveztek. A Fok1 domének dimerként funkcionálnak , amelyhez két olyan konstrukcióra van szükség, amelyek DNS-kötő doménekkel rendelkeznek a genom helyei ellen, fej-farok orientációval és helyes távolsággal. Az aminosavak száma a TALE domén és a Fok1 domén között, valamint a bázisok száma a genom két kötőhelye között két fontos paraméter a kiméra enzim jó aktivitásának biztosításához.
Az aminosav-szekvencia és a DNS-kötő domén által felismert DNS-szekvencia közötti egyszerű kapcsolat lehetővé teszi a személyre szabott fehérjék szintézisét. A TALEN-ek esetében az enzimet kódoló gén mesterséges szintézise problematikus, mert a DNS-kötő domén ismétlődő szekvenciái azt kockáztatják, hogy az oligonukleotidok szintézisének lépései során hibridizálódjanak egymással . Az egyik megoldás ennek a problémának a leküzdésére az, hogy a nyilvánosság számára nyitott szoftvereket ( DNAWorks ) használja a megfelelő oligonukleotidok meghatározására az összeszereléshez két PCR- lépéssel, majd a teljes gén amplifikációjával. Számos más eljárást is kidolgoztak a TALE domainek összeállításához.
A TALEN-eket kódoló gének összeállítása után plazmidokba inszertáljuk . A plazmidokat ezután felhasználják a kívánt sejtek transzfektálására, ahol a TALEN fehérje expresszálódik és átjut a sejtmagba, hogy hozzáférjen a genomhoz. A TALEN-eket mRNS formájában is be lehet juttatni a sejtbe, amely kiküszöböli a TALEN-t kódoló gén genomiális integrációjának lehetőségét.
A TALEN-ek felhasználhatók genom-módosítások elvégzésére azon képességük révén, hogy képesek kiváltani a DNS kettős szálszakadásokat (DSB-ket), amelyekre a sejtek DNS-helyreállítási mechanizmusokon keresztül reagálnak . A nem homológ végösszekötő (NHEJ) helyreállítás lehetővé teszi a kettős szálú törésből származó két DNS-vég újracsatlakozását, ha nem áll rendelkezésre komplementer szekvencia, amely modellként szolgálna a javításhoz. Ez a javító mechanizmus hibákat idéz elő a genomban inszerciók és / vagy deléciók révén; valamint a kromoszómális átrendeződések. Mindezek a hibák valószínűleg nem működőképessé teszik az ebben a lokuszban kódolt génterméket . Mivel az enzim aktivitása az alkalmazott fajtól, sejttípustól, célgéntől és nukleáztól függően változhat, ezeket a paramétereket figyelembe kell venni a TALEN tervezésénél, és figyelembe kell venni a mutációk keletkezését. Egy egyszerű heteroduplex hasítási kísérlet kimutathatja a PCR-rel amplifikált két allél közötti különbségeket. A hasítási termékeket agaróz gélen lehet megjeleníteni . Alternatív megoldásként a DNS-t be lehet vinni a genomba, kihasználva az NHEJ előnyét, vigyázva exogén DNS-forrás biztosítására .
A homológ rekombináció lehetővé teheti idegen DNS bevezetését is a törés helyére, a transzfektált kettős szálú DNS-t a javító enzimek templátként használhatják.
A TALEN-eket emberi embrionális őssejtek és genetikailag módosított iPS- sejtek előállítására használták, de különböző organizmusokban, például C. elegans-ban , patkányokban, egerekben vagy akár zebrafish-ban is kiütések előidézésére . Kimutatták azt is, hogy két TALEN pár használata egyszerre két gén egyidejű módosítását teszi lehetővé. A közelmúltban ez a technika is használható generálni knock-in . Így TALEN-eket injektáltunk patkány petesejtekbe, amelyek lehetővé tették a glükokortikoid receptor kopogtató patkányainak előállítását.
Ha egy TALEN nem elég specifikus a célhelyére, vagy nem céloz egyedi szekvenciát a kérdéses genomban, akkor nem kívánt hasítások történhetnek. Ez a fajta műtárgy elegendő kétszálú törést okozhat a DNS-javító gépezet elborítására, ami kromoszóma-átrendeződést vagy akár sejthalált eredményezhet . Ezek a nem specifikus hasítások más mesterséges nukleázokkal, például cinkujj nukleázokkal is lejátszódhatnak , amelyek nem specifikus hatását jobban jellemzik.