A proteomika az a tudomány, amely a proteomot , vagyis egy sejtben, egy organellában , szövetben, szervben vagy organizmusban lévő fehérjét vizsgálja valamikor és adott körülmények között.
A gyakorlatban a proteomika globális módon próbálja azonosítani a sejttenyészetből, egy szövetből vagy egy biológiai folyadékból kivont fehérjéket, azok helyét a sejtrészekben, esetleges transzláció utáni módosításokat , valamint mennyiségüket.
Lehetővé teszi számukra az expressziós szint változásait az idő, a környezetük, a fejlettségi állapotuk, az élettani és kóros állapotuk , a származási fajok függvényében. Azt is tanulmányozza, hogy a fehérjék milyen kölcsönhatásokat mutatnak más fehérjékkel, DNS-sel vagy RNS-sel vagy más anyagokkal.
A funkcionális proteomika az egyes fehérjék funkcióit vizsgálja.
A proteomika a primer , a szekunder és a tercier fehérje szerkezetét is megvizsgálja .
A proteomika kifejezés új keletű. 1997- ben használta először tudományos publikációban P. James. cikkében: A fehérjék azonosítása a posztgenomikus korban: a proteomika gyors emelkedése . A proteomból származik , amely kifejezés 1995-ben jött létre, a genomikával analóg módon, amely maga is a genom kifejezésből származik , egy szervezet génkészletéből . A proteomikai elemzés egy dinamikus vizsgálat. Egyetlen genom különböző proteomokhoz vezethet, a sejtciklus stádiumától, a differenciálódástól, a különböző biológiai vagy fizikai jelekre adott válaszoktól, a patofiziológiai állapottól függően . A proteom e sejtes események visszahatásait tükrözi mind transzlációs, mind posztszintű szinten. -fordítás. Ebből a szempontból csak a közvetlen fehérjeelemzés adhat globális képet a biomolekuláris rendszerek komplexitásáról.
A tudósokat jóval a proteomika születése előtt érdekelték a fehérjék . Már 1833 , Anselme Payen és Jean-Francois Persoz izolált malátakivonat egy enzimet , amely képes katalizálni a degradáció a keményítő cukor. 1965-ben André Lwoff , François Jacob és Jacques Monod fiziológia vagy orvostudományi Nobel-díjat kapott " az 1961-ben megjelent kutatásukért, amely az enzimek termelésének szabályozását a gének szintjén szabályozza" .
Számos, még mindig széles körben alkalmazott technikát fejlesztettek ki.
Az elektroforézis technikáját 1892-ben fejlesztette ki SE Linder és H. Picton. Az elv a kromatográfia nyúlik vissza, 1861 által Friedrich Goppelsröder .
// freskót teszünk, amely bemutatja a fehérjék vizsgálatának időrendjét
Az elmúlt tíz évben a proteomika önálló tudománysá vált, saját technikákkal és módszerekkel. A proteomikát 2002-ben jutalmazták kémiai Nobel-díj megszerzésével
Számos olyan technológiát kölcsönzött, amelyeket korábban más tudományterületeken is alkalmaztak, és ezeket felhasználta a fehérjék tanulmányozásához. Megemlíthető például a fizikából és a kémiai elemzésből származó tömegspektrometria alkalmazása a fehérjék azonosításában, a fehérje expresszió számszerűsítésében, a peptidek szövetben történő lokalizálásában, a specifikus anyagok keresésében. a patológiák biomarkerei .
Végül a szekvenálási projektek (különösen az emberi genom) kihívásai és eredményei indokolják a proteom mélyreható tanulmányozását. Az a „ meglepő ” felfedezés, miszerint ez a genom az előre jelzettnél jóval kevesebb gént tartalmaz, bizonyítja a fehérjék, mint a biológiai folyamatok központi szereplőinek fontosságát.
A proteom elemzésére alkalmazott módszerek sematikusan két nagy csoportra oszthatók: az elsőben a "valódi laboratóriumban" (nedves laboratóriumban) végrehajtott kísérleti módszerek csoportosíthatók, amelyek főként az elválasztás és a fehérje-elemzés technikáira épülnek. . A „virtuális laboratóriumban” (száraz laboratóriumban) megvalósított módszerek második csoportja képelemzést és bioinformatikát foglal magában . Az elemzés fő szakaszaiban valós és virtuális laboratóriumokat használnak.
A gyakorlatban a fehérjéket először egy sejtpopulációból vagy szövetből vonják ki, majd az azonosítás előtt elválasztják őket.
Az első lépés általában a fehérjék kivonása egy biológiai mintából. Ez a lépés kulcsfontosságú: a nem megfelelő extrakció fehérjebontást eredményezhet, és megnehezítheti vagy akár lehetetlenné teszi a fehérjék azonosítását. A sok aminosavat tartalmazó hidrofób és ezért rosszul oldódó membránfehérjéket nehéz tanulmányozni.
Egyes technikák nem igénylik a fehérjék kivonását a vizsgált szövetből. Az immunolokáció során a szövetet rögzítik , majd néhány mikron vastag vékony csíkokra vágják. Ezután a fehérjéket in situ detektáljuk jelölt antitestekkel . A tömegspektrometria képalkotás , szöveti metszeteket közvetlenül elemeztük egy MALDI-TOF- típusú tömeges spektrométer .
Az elemzés egyszerűsítése érdekében az extrakciót gyakran a transzláció utáni módosítások kiküszöbölésével hajtják végre . Csak a fehérjék elsődleges szerkezete , vagyis szekvenciái maradtak fenn. De ha az elemzés tárgya ezek a transzláció utáni módosítások tanulmányozása, meg kell tenni a szükséges óvintézkedéseket azok megtartásához.
A második lépés lehetővé teszi a fehérjék szétválasztását fizikai vagy kémiai jellemzőik vagy a ligandum iránti affinitásuk szerint.
Az elektroforézis szétválasztja a fehérjéket egy poliakrilamid gélben, molekulatömegük szerint, amikor elektromos mezőnek vannak kitéve. A proteomika standard elektroforézis módszere a kétdimenziós elektroforézis .
A kromatográfia felhasználja a fehérje affinitásbeli különbségét a mozgófázis és az állófázis között.
A fehérjeválasztás alapelve kétdimenziós elektroforézisselA kétdimenziós elektroforézis lehetővé teszi a komplex fehérjekeverékektől, hogy több száz vagy akár több ezer fehérjét foltként vagy "foltként" szemléljenek. A kapott felbontás elegendő az izoformák jelenlétének bizonyításához.
Elve a fehérjék töltésük szerinti szétválasztása ( izoelektromos fókuszálás ), majd az ortogonális elválasztás, a molekulatömegüknek megfelelően. Az első dimenzió felbontása 0,01 pH egység nagyságrendű.
A kapott géleket ezután megfestjük, majd digitalizáljuk. Az eredmény egy félkvantálás.
Érdeklődő fehérjék keresése képelemzésselMa két fő megközelítés létezik, a 2-DE gélek képelemzéséből kiindulva, lehetővé téve a kvantitatív proteomika kezelését. E módszerek egyike több gél statisztikai összehasonlítását alkalmazza, a másik pedig a fehérjék kémiai származékát alkalmazza fluoreszcens próbákkal, amely lehetővé teszi több minta együttes elemzését egyetlen gélen. Ehhez mindkét esetben képalkotó szoftvert használnak. Valójában lehetetlen egyedileg felfogni a 2D gélen oldódó jelentős számú (néha 2000-ig terjedő) foltot (5. ábra). Ezek a többszörös foltok megfelelnek a két dimenzióban elválasztott fehérjék izoformáinak. A polipeptid foltok gélen való elhelyezkedése megismételhető az Immobilin gradiens szétválasztó rendszerekben. A helyzetváltozás tehát a transzláció utáni módosítás indikátora, amely befolyásolja annak terhelését és / vagy méretét.
A képelemzés a 2-DE gél képének festés utáni digitalizálásán alapul. Ebben a lépésben a szoftver pixelekre vágja a képet (a képelem összehúzódása) az adatátvitel és tárolás céljából. A kép minden pixelét x és y helyzetben rögzítik, amelyhez egy optikai sűrűség (OD) érték társul, arányos a kamera vagy a szkenner által rögzített jel intenzitásával. Ahhoz, hogy az OD jó mérési paraméter és a fehérje expressziójának tükrözője legyen, az alkalmazott festésnek nagy dinamikatartománnyal kell rendelkeznie, és ha lehetséges, lineárisnak. Egy gélben az OD szempontjából a legkisebb detektálható és a legnagyobb folt intenzitási aránya 104-es nagyságrendű, míg a fehérjék expressziójának dinamikája a sejtben 105 és 106 között van. Ezért jelentős hiány analitikai tartomány, amelyet az elemzés során figyelembe kell venni.
A fehérjék 2-DE gélben történő festése főleg szerves színezékek, például Coomassie kék , fémek, például ezüst-nitrát, vagy más módon fluoreszcens próbákon alapul. A detektálási tartomány körülbelül 10 000-szeres mértékben változik a Coomassie kéket használó módszerek (µg nagyságrendű fehérjét tartalmazó foltok kimutatása) és az ezüst-nitrátot alkalmazó módszerek között, amelyek 0,1 ng elérését teszik lehetővé. A fluoreszkáló festékek kevésbé érzékenyek, mint az ezüst-nitrát, azonban nagyobb a reprodukálhatóságuk és a dinamikatartományuk.
A jelenlegi képelemző szoftver a gélfoltok 3D-s megjelenítésének elemeit tartalmazza, lehetővé téve az x, y és z szögek változását, amelyek rendkívül hasznosak a közeli foltok elválasztására. A számszerűsítés így javul. Az ilyen eszközök használata lehetővé teszi a gélek elemzéséhez kapcsolódó szűk keresztmetszetek jelentős bővítését. A megbízható differenciálanalízishez azonban legalább három-négy gél sorozat összehasonlítása szükséges. Az olyan statisztikai tesztek, mint a heurisztikus elemzés vagy a megfelelés elemzése, objektíven lehetővé teszik a különböző kísérleti sorozatok géljei közötti diszperzió meghatározását.
A statisztikailag megbízható differenciális kvantifikáció eléréséhez szükséges 2D gélek megsokszorozása azonban hátrány a nagy áteresztőképességű elemzésekhez, amelyek számára érdekes az egy géles technika. Differenciálanalízis egyetlen gélen: (DIGE technológia a gélelektroforézis differenciálására) a GE (korábban) Amersham Biosciences vezette be a piacra. Az elv azon a kovalens jelölésen alapul, amelyet két elemzendő kivonatban lévő fehérjék fluoreszcens cianinok (pl. Cy2, Cy3 és Cy5) alkalmazásával jelölnek. Három szerkezet áll rendelkezésre különböző fluoreszcencia spektrumokkal. N-hidroxi-szukcinimidil-észter-csoportjuk is van, amely lehetővé teszi a fehérjék lizinjeinek epsilonban lévő aminocsoportjával történő nukleofil szubsztitúciós reakcióval amid képződését. A DIGE gél képeinek elemzése könnyebb, mivel a két minta ugyanazon a gélen vándorolt. A két hullámhosszon készített képeket egymásra helyezzük és kvantitatív módon összehasonlítjuk megfelelő szoftverrel, belső referencia hozzáadásával. A kétszínű összehasonlító vizsgálat olyan fehérjék bemutatását eredményezi, amelyek különböznek vagy azonosak a két mintában. A belső standard meglétének lehetősége növeli a kvantitatív mérések megbízhatóságát. Bármilyen elemzési módszert is alkalmazzunk, az egyszer észlelt érdeklődési pontokat kivágjuk a gélből, hogy spektrometrikus módszerekkel (tömegspektrometria MALDI-TOF módban vagy tandem MS / MS módban) azonosíthassuk őket. A differenciálelemzés mellett a képelemzés lehetővé teszi a WEB-en megtekinthető adatbázisok alapjául szolgáló referencia-térképek összeállítását és feljegyzését.
Az MS által történő azonosítás az ionizált peptidek tömegének pontos mérésén alapul. Nagyon általánosságban a fehérjéket egy endopeptidáz (leggyakrabban tripszin) emészti, majd SM elemzi.
Az egyik alkalmazott megközelítés a tömeges peptidtérképek létrehozása (angolul: peptid tömeges ujjlenyomat , francia peptid tömeg ujjlenyomat (in) vagy peptid tömeg tömeg ujjlenyomat). A proteáz emésztése után kapott peptidek tömegét összehasonlítjuk az adatbázisokban felsorolt fehérjék elméleti tömegtérképével. Különböző algoritmusokat fejlesztettek ki a kutatás megkönnyítésére. Az MS adatelemző szoftver egy fehérjetsort keres (a kísérletező által meghatározott kritériumok szerint) egy szekvencia adatbázisban, és mindegyikhez létrehoz egy elméleti spektrumot, hogy lássa, melyik áll a legközelebb a kísérleti spektrumhoz.
Az egyes algoritmusok eltérő logikája szerint megállapítanak egy pontszámot minden " in silico " elemzett szekvenciára, ami a jelölt fehérjék rangsorához vezet. Ez a megközelítés azonban objektív korlátoktól szenved, és nehéz azonosítás esetén a különböző szoftverek listát adnak a különböző jelölt fehérjékről. Például az a szoftver, amely figyelembe veszi a jelölt fehérje elméleti spektruma és a kísérleti spektrum közötti közös tömegek számát, előnyben részesíti azokat a nagy molekulatömegű fehérjéket, amelyekre a szekvenciából nagyobb számú virtuális peptid vezethető le.
A problémát megkerülik a fehérjék részleges szekvenálása tandem tömegspektrometriával (MS / MS). Az első MS során elemzett bizonyos peptidfragmentumokat ezután kiválasztjuk és fragmentáljuk. A kapott tömegcsúcsok képviselik a fehérje szekvenciát, amelyben két szomszédos csúcs különbözik az elemzett peptid fragmentálása során elveszett aminosav tömegétől. A rövid fehérjeszekvencia analógiája ezután kereshető az adatbázisokban. Ha ezek a szekvenciák közösek egy fehérjecsoportban, akkor az izoelektromos pont és az elektroforézissel történő elválasztás során meghatározott látszólagos tömeg lehetővé teszi a döntést. Az információk (néhány aminosav rövid szekvenciája, a 2D elektroforézis foltját tartalmazó ablak helye, állatfajok és sejttípus, amelyből a minta származik) keresztellenőrzése növeli a polipeptid azonosításának megbízhatóságát.
Ahelyett, hogy egyszerűen meghatároznánk a peptidszekvenciát a peptid tömegspektrumából, és fehérjék vagy DNS adatbázisának bányászatára használnánk , az MS / MS spektrum összehasonlítható az MS spektrumok sorozatával. / Virtuális MS az adatbázisok fehérjeszekvenciáiból származik. . Ugyanezen elv alapján először lehetőség van a triptikus emésztésből származó peptidek folyadékkromatográfiai nano-módszerrel (nanoLC) történő szétválasztására és MS / MS végrehajtására ezeken a különböző peptideken. A fehérje különböző szegmenseire vonatkozó információk megsokszorozása lehetővé teszi nemcsak az azonosítás megszilárdítását, hanem strukturális információk megszerzését is, különösen a poszttranszlációs módosításokról, például foszfátcsoportok hozzáadásáról (foszforiláció) vagy oligoszacharidláncokról (glikozilezés). Funkcionális szempontból ez az információ alapvető. A foszforilációk képezik az alapját a jelek vezetésének a sejtben, azon kívülről a membránreceptorain keresztül a sejtmagig, ahol a sejtek életét szabályozó információ centralizált. Ami az oligoszacharid-láncokat illeti, kulcsfontosságú szerepet játszanak bizonyos fehérjék (glikoproteinek) kémiai tulajdonságainak modulálásában, és néha szabályozzák azok biológiai aktivitását. E csoportok azonosításához az SM a peptidlánctól elválasztásukból vagy a saját fragmentációjukból származó fragmenseket fogja használni.
Adatbázisok lekérdezéseEz a proteomikus számára az utolsó lépés, amelyet a bioinformatika fejlődése tett lehetővé .
A fehérjékről gyűjtött különféle információkat (látszólagos tömeg, valós tömeg, izoelektromos pont, fragmensek nagysága enzimatikus emésztés után, részleges szekvenciák) összehasonlítjuk az online genomikus vagy proteomikus adatbázisokkal. Ezután a szoftver felsorolja a fehérjék és a hozzájuk kapcsolódó valószínűségek listáját.
Olyan organizmusok esetei, amelyek genomját még nem szekvenálták;
Csak bizonyos szervezeteknek, úgynevezett „ mintaszervezeteknek ” van teljesen szekvenált genomja, és elérhetőek online. a többi organizmust homológ módon vizsgálják az ismert organizmusokkal.
Lehetővé teszi az expressziós szintek variációinak számszerűsítését az idő, környezetük, fejlődési állapotuk, fiziológiai és kóros állapotuk, valamint a származási fajok függvényében.
A leggyakrabban alkalmazott technikák:
Azt is tanulmányozza, hogy a fehérjék milyen kölcsönhatásokat mutatnak más fehérjékkel, DNS-sel vagy RNS-sel, anyagokkal.
A fehérje kölcsönhatások vizsgálatának másik módja egy kettős hibrid létrehozása . Egy cDNS-könyvtár szűrésével, amelynek fehérjéje csali, az összes interraktáns kimutatható egy adott organizmusban vagy szövetben (állatban vagy növényben). Helyesen alkalmazva ez a technika nagyon hatékony. Az eredmények minősége gyakran függ a könyvtár minőségétől és az élesztő vagy baktériumok transzformálásának hatékonyságától.
A funkcionális proteomika az egyes fehérjék funkcióit vizsgálja.
A proteomika végül a fehérjék primer , szekunder és tercier struktúráját tanulmányozza .
A rákos sejtek kinomáinak összehasonlító vizsgálata lehetővé teszi a rezisztencia mechanizmusainak tanulmányozását és az új terápiás célok azonosítását.