A géntechnológia az az eszközkészlet, amely megváltoztatja egy szervezet genetikai összetételét a DNS eltávolításával, beillesztésével vagy helyettesítésével .
Ezt be lehet vezetni közvetlenül a sejtek a gazdaszervezet vagy a tenyésztett sejtek ex vivo , majd visszahelyezték a szervezetbe. A géntechnológia fejlesztésének előfeltétele a rekombináns nukleinsav- technikák kifejlesztése volt , amelyek örökletes genetikai anyag új kombinációinak kialakítására irányultak, majd ezt az anyagot közvetetten egy vektorrendszeren keresztül vagy közvetlenül mikroinjekcióval, makroinjekcióval vagy mikroinjekcióval építették be. Egységbezárás.
Célja gyakran a genotípusok , tehát a fenotípusok módosítása .
A géntechnológia nagyon aktív kutatási terület, mivel a biotechnológiai mezőgazdaságban a lehetséges alkalmazások sokfélék, különös tekintettel az emberi egészségre ( káros mutációt hordozó gén korrekciója , terápiás fehérjék termelése , a perzisztens vírusszekvenciák kiküszöbölése stb.) ( géntechnológiával módosított növények új generációinak kifejlesztése stb.), vagy akár kutatásra szánt eszközök kifejlesztésére (például egy gén funkciójának feltárására).
A géntechnológia exponenciális fejlődését követően az 1960-as években megjelent egy új tudományág , a bioetika , amelynek célja, hogy a kutatókat, de a politikusokat és a nagyközönséget is érzékenyítse az etikai dimenzió mielőbbi szisztematikus bevezetésének szükségességével . elővigyázatosság elve ).
A 20. század elején Mendel (1822-1888) és Morgan (1866-1945) Drosophila légyen végzett munkájának újrafelfedezése lehetővé tette annak megértését, hogy az öröklődés a géneknek nevezett részecskék átterjedésének köszönhető. , lineárisan rendeződve a kromoszómákon . Az 1950-es években a gének kémiai természetére, valamint a DNS molekulaszerkezetére derült fény . A 1965 , felfedezés restrikciós enzimek megerősített 1973 by Paul Berg és kollégái. Ezek a fehérjék, amelyek képesek pontosan vágni és újraragasztani a DNS - t , olyan eszközöket adnak a kutatóknak, amelyek hiányoztak a genom feltérképezéséhez . Ez megnyitja az utat a transzgenezishez is , amely lehetővé teszi az in vitro beavatkozást a DNS és ezáltal a gének részein . A technológia a rekombináns DNS lehetővé teszi a behelyezését egy részének DNS (egy vagy több gén) egy másik DNS .
Bizonyos organizmusokban a génnek az élő sejtbe történő bejuttatására kifejlesztett technológiák továbbra is korlátozottak az új szekvencia genomba történő beillesztésének véletlenszerű jellege által. Véletlenszerűen elhelyezve az új gén inaktiválhatja vagy megzavarhatja a harmadik féltől származó gének működését, vagy akár súlyos nemkívánatos hatásokat is kiválthat, például rákos megbetegedési folyamatot válthat ki. A nem célzott beillesztési technológiák nem teszik lehetővé a kísérlet megismételhetőségét: nincs garancia arra, hogy az új szekvencia mindig ugyanazon a helyen legyen.
Az 1990-es évek vége óta a technológiák új generációja kihasználja a legújabb ismereteket és technológiákat, például a programozható nukleázokat (ZNF-ek, TALEN-ek és CRISPR). Lehetővé teszik a DNS meghatározott területének beavatkozását a korrekció vagy az elvégzett inszerció pontosságának növelése érdekében, ezáltal megakadályozva a sejttoxicitásokat és megbízhatóan reprodukálhatóvá téve a beavatkozást.
Ezek az új genomtechnikai technológiák a szintetikus genomikával (a mesterséges genomok kialakításával) együtt jelenleg az alkalmazott biológiai kutatás és az ipari innováció szempontjából a legígéretesebb technológiák közé tartoznak.
A GMO-k előállítása lehetővé teszi új gének bevitelét az élőlény genomjába a DNS- részek beillesztésével , vagy bizonyos jelenlévő gének törlését vagy módosítását. Ezek a módosítások különféle géntechnológiai eszközöket alkalmaznak, különös tekintettel a transzgenesisre és az újabban programozható nukleázokra (pontosabban a CRISPR eszközre ).
A géntechnológia a XX . Század egyik legnagyobb tudományos fejlődése . Valóban erős fejlesztési potenciállal rendelkezik. Azonban az alkalmazási lehetőségek, amelyeket az orvosbiológiai kutatás kínál , annyi félelmet ébreszt, mint reményt. Ezért jelent meg az 1960-as években egy új tudományág , a bioetika , amelynek célja, hogy a kutatók, de a politikusok és a nagyközönség is tudatosítsa az etikai dimenzió szisztematikus bevezetésének szükségességét a kutatási fázistól kezdve.
2015-ben az Egyesült Államok Nemzeti Orvostudományi Akadémiája nemzetközi csúcstalálkozót szervezett, hogy felhívja a figyelmet a géntechnológia kockázataira, amelyek a szervezők számára még fontosabbak: az eugenika . Egy másik kockázat a géntechnológia következményeinek bizonytalansága: tekintettel az emberi genom összetettségére és az összes különböző gén kölcsönös függőségére, egyetlen gén módosítása a genom más részeire is hatással lesz. Azonban először úgynevezett GMO-csecsemők születtek Kínában, valójában a CRISPR-Cas9 technológiának köszönhetően, amely egy új orvosi innováció, amelyet 2012-ben fejlesztett ki a francia Emmanuelle Charpentier és az amerikai Jennifer Doudna. He Jiankui kínai kutató arra használta, hogy megakadályozza Lulu és Nana ikrek HIV-fertőzését. Az új Cas9 technológia lehetővé teszi bizonyos gének kivágását, azonban ezt soha nem kísérelték meg az életben maradásra szánt embriókon.
Jean-François Gariépy quebeci biológus arra figyelmeztet, hogy a géntechnológia az emberi szaporodás jelenlegi mechanizmusainak pótlásához vezethet. A monográfiai forradalmi fenotípusban ( A forradalmi fenotípus ) Gariépy ezt az elméletet azon RNS-világ feltételezésére alapozza , amelyben az RNS-t lecserélték a DNS-re, mint replikátorra, amely uralja a világot. Ha az emberiség ezt az utat választotta, akkor ennek következménye hosszú távon bármely emberi társadalom radikális átalakulása lenne, a géntechnológia folyamatát manipuláló erők érdekeinek megfelelően.
A transzgenézis abból áll, hogy egy exogén DNS-t egy szervezet genomjába vírus vagy baktérium segítségével juttatnak be, vagy a DNS-t fizikai-kémiai módszerekkel (elektroporáció, transzfekció vagy mikroinjektálás) vezetik be. Az első transzgénikus egeret Rudolf Jaenisch biológus hozta létre 1974-ben. Az első transzgénikus növényeket 1984-ben hozták létre Agrobacterium tumefaciens mint exogén DNS-vektor felhasználásával. A transzgenesis megközelítések egyik fő korlátja, hogy az exogén genetikai anyag véletlenszerűen kerül beillesztésre. Ha az inszerció egy endogén gén közelében történik, az utóbbi expressziójában hibához vezethet.
A transzgenesistől eltérően a homológ rekombinációs megközelítések lehetővé teszik a genetikai anyag bevezetését, eltávolítását vagy helyettesítését nagyon precíz módon. Ezek a megközelítések azon a mechanizmuson alapulnak, amely a sejtekben természetesen jelen van a sérült DNS helyrehozására, egy templátként egy másik szálon elhelyezkedő homológ szekvencia alkalmazásával.
Lehetőség van homológ rekombinációk kiváltására a sejt természetes DNS-e és a kutatók által bevezetett exogén DNS között, vektorként például egy retrovírus módosított genomját felhasználva. A rekombináció jelensége elég rugalmas ahhoz, hogy lehetővé váljon egy bizonyos szintű változás (a DNS egy részének hozzáadása, törlése vagy módosítása) bevezetése a megcélzott homológiai zóna szintjén.
Már az 1980-as években Mario R. Capecchi és Oliver Smithies a homológ DNS rekombináción dolgozott, mint „génmegcélzó” eszköz, azaz mint eszköz a specifikus gének inaktiválására vagy módosítására. Martin J. Evans közreműködésével kifejlesztettek egy módszert az egerek genomjának módosítására az egér embrionális őssejtek tenyészetben történő DNS-módosításával , és e módosított őssejtek egér embrióiba történő injektálásával. Az így létrehozott genetikailag módosított egerek lehetővé teszik az emberi betegségek laboratóriumi vizsgálatát. Ma már az orvosi kutatásban általánosan használt eszköz. A három kutató munkája 2007 -ben fiziológiai vagy orvosi Nobel-díjat kapott .
A genetikai módosítás homológ rekombinációval történő megközelítésének fontos korlátja a nagyon alacsony spontán aktivitása, kivéve az élesztőt és az egér embrionális őssejteket, amelyek kivétel. Ez szigorúan korlátozta alkalmazását más szervezetekre. Az 1990-es évek közepén azonban Maria Jasin és Jean-François Nicolas csapatai bebizonyították, hogy az emlőssejtek DNS-ében lévő kettős szálszakadás nagyon erősen serkenti a homológ rekombinációt (amelyet a sejt használ a törés kijavítására.). Ezenkívül a javítás utáni DNS-szekvenciák elemzése megmutatja egy második DNS-helyreállítási útvonal működését, az úgynevezett nem homológ végek találkozását , ami kis DNS-szekvenciák (általában 1-20 nukleotid hosszúságú) deléciójához vagy inszerciójához vezet. Ezek a megfigyelések ezért arra késztették a kutatókat, hogy kifejlesszenek olyan nukleázokat (enzimek, amelyek vágják a DNS-t), amelyek cél DNS-szekvenciája programozható.
A molekuláris biológiában a DNS vágására általánosan használt restrikciós enzim 1-10 nukleotidból álló blokkokkal lép kölcsönhatásba. Ezek a nagyon rövid és gyakran palindróm szekvenciák általában a genom több helyén vannak jelen (az emberi genom 6,4 milliárd bázist tartalmaz). A restrikciós enzimek ezért valószínűleg többször is levágják a DNS-molekulát.
A pontos és biztonságos genomműtét elvégzéséhez a tudósok ezért pontosabb eszközökhöz folyamodtak. A célzott genomtervezést olyan enzimek teszik lehetővé, amelyek képesek felismerni és kölcsönhatásba lépni a DNS-szekvenciákkal elég hosszú ideig ahhoz, hogy minden valószínűség szerint csak egyetlen példányban létezzenek egy adott genomban. Ezután a DNS-re történő beavatkozás pontosan a megcélzott szekvencia szintjén történik. A felismerési helyek több mint 12 bázispár, meganucleases , cink-ujj nukleázok , Talens és CRISPR rendszerek megfelelnek ezeknek specificitás kritériumoknak.
Miután a DNS-t levágták, a természetes DNS-helyreállítási mechanizmusok és a homológ rekombináció lehetővé teszi egy módosított szekvencia vagy egy új gén beépítését.
E különböző lépések (felismerés, hasítás, rekombináció) sikere különféle tényezőktől függ, amelyek között szerepel az enzimet a sejtbe juttató vektor hatékonysága, az enzimatikus hasítási aktivitás, a homológ rekombináció sejtteljesítménye és valószínűleg a kromatin a figyelembe vett lokuszon .
MeganukleázokAz 1980-as évek végén felfedezett meganukleázok az endonukleáz családból származó enzimek, amelyek jellemzői a nagy , 12-40 bázispár DNS-szekvenciák felismerése. Ezen meganukleázok közül a LAGLIDADG csoport fehérjéi vannak, amelyek nevüket egy konzervált aminosav-szekvenciának köszönhetik , és amelyek a legismertebbek.
Ezeket az enzimeket már az 1990-es években azonosították a genomtervezés ígéretes eszközeként. Mindazonáltal, annak ellenére, hogy sokféleségük van a természetben, és annak ellenére, hogy mindegyiknek kicsi a variációja a DNS-felismerési helyén, túl kevés az esély arra, hogy d Jól meghatározott DNS szekvenciáján megtalálja a beavatkozásra alkalmas meganukleázt. Ezért minden új genomtechnikai cél megköveteli a fehérjetechnika első szakaszát a testre szabott meganukleáz előállításához.
Cinkujj nukleázokA cinkujj nukleázok enzimszintetikus korlátozások, amelyek a cinkujjdomének doménjeinek a DNS hasításával egyesülnek.
6-8 cinkujj kombinációja, amelyek felismerési doménjeit jellemezték, specifikus fehérjéket nyerhetünk körülbelül húsz bázispár szekvenciákhoz. Így lehetséges egy adott gén expressziójának szabályozása. Kimutatták, hogy ez a stratégia lehetővé teszi az állatok angiogenezisének elősegítését . Az így felépített fehérje összeolvasztható az endonukleáz katalitikus doménjével is annak érdekében, hogy a DNS célzott törését okozza, és ezeket a fehérjéket géntechnológiai eszközökként használják.
A cinkujj nukleázok olyan kutatási és fejlesztési eszközök, amelyeket már használtak a különféle genomok módosítására, különösen a Cink Ujj Konzorciumban szövetségi laboratóriumok. Az amerikai Sangamo Biosciences cég cinkujj nukleázokat használ az őssejtek géntechnológiájával és az immunsejtek terápiás célú módosításával kapcsolatos munkákhoz. A módosított T-limfociták jelenleg az I. fázisú klinikai vizsgálatok tárgyát képezik, amelyek az agyrák (glioblastoma) kezelésére és az AIDS elleni küzdelemre összpontosítanak.
TALENA TALEN-ek mesterséges restrikciós enzimek, amelyeket a TALE nevű DNS-kötő domén és egy DNS hasításának képességével egyesítenek.
A DNS-kötő TALE domén 33 vagy 34 azonos aminosav ismétléséből áll, a 12. és 13. aminosav kivételével. Ez utóbbi két maradék lehetőséget ad egy modulnak arra, hogy nagyon egyszerű kód szerint felismerje a DNS-bázist. Ezeknek a moduloknak a kívánt sorrendben történő összeállításával nagyon könnyű olyan fehérjét előállítani, amely felismeri a genom egy meghatározott szekvenciáját. Ennek a TALE doménnek a fúziója egy DNS hasítási doménnel nagyon könnyen lehetővé teszi kettős szálú törések kiváltását egy kívánt génben.
Az ilyen enzimek gyors felépítése és alacsony költségük kiváló eszközzé teszik őket a géntechnológia végrehajtására.
Ezen új módszerek szabályozása érdekében a különféle kormányok létrehozták a géntechnikai bizottságot , amelyet 2008. december 8-án feloszlattak, és a biotechnológiai főtanácsot 2008 júniusában.
Az emberi jogok és a biomedicina védelméről szóló egyezmény 5. fejezetének 18. cikke szerint, amikor a törvény megengedi az in vitro embriók kutatását , az biztosítja az embrió megfelelő védelmét. Tilos emberi embriókat kutatási céllal létrehozni.
A He jiankui kutató által végrehajtott módosítások tehát az 1997-es oviedo-egyezmény szerint törvényellenesek.
2018 novemberében két kínai iker született, akiknél mutációt vezettek be, amely megóvja őket a HIV-től a CRISPR-Cas9 nevű genomszerkesztési technikának köszönhetően. Ez az esemény rávilágított a nemzetközi konszenzus hiányára és az államok gyakorlatában mutatkozó eltérésekre a CRISPR technika embereken történő alkalmazásával kapcsolatban, a lényegében nemzeti jellegű kutatások felügyeletével kapcsolatban.
A CRISPR-Cas9, vagy egyszerűbben a CRISPR, egy olyan DNS-mérnöki technika, amely lehetővé teszi egy adott szekvencia hozzáadását, módosítását vagy törlését egy élőlény, baktérium, növény vagy állat genomjából. A korábbi bonyolultan megvalósítható technikákkal ellentétben a CRISPR-Cas9 könnyen használható. Pontosabb, megbízhatóbb és olcsóbb is.
Emberben a CRISPR technika felhasználható mind az embrionális sejtek, mind a felnőtt egyedek módosítására. A beavatkozás összpontosíthat úgynevezett őssejtekre , az összes többi forrására. Két populáció létezik. Először a csíra, a reproduktív őssejtek, amelyeket ivarsejteknek (spermiumoknak és petesejteknek) is neveznek, valamint a zigótában jelen lévő sejtek (az embrió a fejlődés első szakaszában). Ezután szomatikus őssejtek vagy más testsejtek. A ivarsejtek bármilyen módosulása az utódokra terjed, míg egy szomatikus sejten lévő gén módosítása csak a kezelendő embert érinti.