típus | Mikroszkóp , optikai műszer |
---|
Keltezett | 1595 |
---|
Emoji | } |
---|
Az optikai mikroszkóp vagy fotonikus mikroszkóp egy objektívvel és szemlencsével ellátott optikai eszköz, amely lehetővé teszi egy kis tárgy képének nagyítását (amely jellemzi annak optikai erejét), és elkülöníti a kép részleteit (és annak felbontó erejét ). hogy az emberi szem megfigyelhesse. A biológiában használják a sejtek, szövetek megfigyelésére, a kőzettan a kőzetek felismerésére, a kohászaton és a metallográfiában egy fém vagy ötvözet szerkezetének vizsgálatára.
Nem szabad összetéveszteni azzal a binokuláris nagyítóval, amelyhez nincs szükség vékony, lapos mintákra vagy fényvisszaverőre, és előkészítés nélkül lehetővé teszi a természetes részek megfigyelését a kép kis tényezővel történő nagyításával, de a sztereoszkópos látás elősegíti a makroszkopikus vizsgálatot, amely szemcséket, repedéseket tár fel repedések stb.
Jelenleg a legerősebb optikai mikroszkópok nagyítása × 2500.
A látható fényspektrum korlátai miatt az optikai mikroszkópok kellő nagyítással lehetővé teszik a sejtek (de nem minden sejtegységet és alegységet), gombák, protozoonok, baktériumok megfigyelését, de nem teszik lehetővé a vírusok megfigyelését.
Nehéz megmondani, hogy ki találta fel az összetett mikroszkópot. Gyakran mondják, hogy Hans Janssen holland optikus és fia, Zacharias Janssen 1595-ben gyártották az első mikroszkópot, de ez maga Zacharias Janssen nyilatkozatából származik a XVII . Század közepén . Zacharias Janssen 1570 körül született.
Egy másik kedvenc, mint a mikroszkóp feltalálója a Galileo . 1609- ben kifejlesztett egy okchiolino-t , egy konvex lencséből és egy másik konkáv mikroszkópot . Athanasius Kircher 1646-ban leírta mikroszkópját, amelyet a vér megfigyelésére használt.
A mikroszkóp mása: Van Leeuwenhoek (nl) (1676).
Optikai mikroszkóp (1751).
Mandzsetta mikroszkópja (1760).
François-Laurent Villette (1765) mikroszkópja.
Zeiss mikroszkóp, Jena (1879).
Voigt és Hochgesang modell (1890).
Francesco Stelluti három méhecske rajza megjelenik VIII . Urban pápa (1623-1644) pecsétjén, és átkerül az első publikált mikroszkópos képhez. Christian Huygens , egy másik holland, a XVII . Század végén kifejlesztett egy egyszerű kettős szemlencsét, amely korrigálta a kromatikus aberrációkat, ami nagy előrelépés volt a mikroszkóp fejlesztésében. A Huygens szemlencsét ma is gyártják, de meglehetősen kicsi látómezőben és más kisebb problémákban szenved. Általában Antonie van Leeuwenhoek (1632–1723) nevéhez fűződik, mégis felhívta a biológusok figyelmét a mikroszkóp felhasználására, még akkor is, ha a szokásos nagyítókat már a XVI . Században gyártották és használták . Van Leeuwenhoek kézműves mikroszkópjai egyszerű, kisméretű műszerek voltak, amelyek egyetlen, de erős lencsét tartalmaztak. Összehasonlításképpen: több lencserendszert továbbra is nehéz kifejleszteni, és nem kevesebb, mint 150 év optikai fejlesztés kellett ahhoz, hogy az összetett mikroszkóp képes legyen olyan képminőséget biztosítani, mint a Van Leeuwenhoek egyetlen mikroszkópja. Mindazonáltal, és sok állítás ellenére, nem lehet Antoni Van Leeuwenhoeket tekinteni az összetett mikroszkóp feltalálójának. Robert Hooke is az elsők között fogant.
Az optikai mikroszkóp egy lencsékkel ellátott optikai rendszer , amelynek célja a megfigyelt tárgy nagyított képének elkészítése.
A megfigyelendő tárgy az első " objektív " nevű optikai csoport elé kerül . Ha az objektum meghaladja a gyújtótávolságot, akkor egy tényleges, fordított képet készít, amely más méretű; a kép nagyobb, mint az objektum, ha az objektum a lencse gyújtótávolságának kétszeresénél kisebb távolságra helyezkedik el.
A megfigyelő oldalán a második optikai csoport a szemlencse : úgy van elhelyezve, hogy a kép a fókuszsíkjában legyen. Így a szem "végtelenben" figyel egy képet (egy szokásos megfigyelő számára), ezért a szállásért felelős izmokat ellazítva jobb vizuális kényelmet nyújt.
Ez egy dioptrikus központú rendszer, amely részben dublettekből áll az optikai rendellenességek némelyikének korrigálására .
Ellentétben más optikai rendszerek, amelyek által meghatározott azok optikai nagyítással ( teleszkóp ) vagy ezek nagyítás ( kamera ), a megfelelő kifejezés, a mikroszkóp, az a teljesítmény , aránya a szög, amely alatt az objektum látható. Keresztül a műszer, annak a tárgynak a hosszáig.
A klasszikus széles látóterű mikroszkópia során a legszélesebb körben alkalmazott megvilágítási technika a Köhler-megvilágítás , amely garantálja az optimális képminőséget.
Alulról felfelé:
Az okulár helyettesíthető fényképezőgéppel, vagy - videomikroszkópia esetén - videokamerával vagy CCD- kamerával a digitális felvétel érdekében. Ez lehetővé teszi a megfigyelés elvégzését egy videomonitoron (televízió típusú képernyő), és megkönnyíti a képek felhasználását és feldolgozását (nyomtatás, számítógépes feldolgozás, telemedicina stb.).
A mikroszkóp felbontása arra utal, hogy nagyon hasonló részleteket képes elkülöníteni. A használt érzékelőtől és a lencsék eltéréseitől vagy tökéletlenségeitől függetlenül az optikai mikroszkóp felbontását alapvetően korlátozza a fény diffrakciója . A diffrakció miatt a pont képe nem pont, hanem folt (a Levegős folt vagy általánosabban a pontterjesztési funkció - PSF). Így két különálló, de szomszédos pont lesz a képek számára két folt, amelyek átfedése megakadályozhatja a két képpont megkülönböztetését: a részletek ezután már nem oldódnak meg.
Abbe elmélete szerint a mikroszkóp (keresztirányú) felbontási határa , vagyis az a legkisebb távolság, amely alatt két szomszédos pont már nem lesz megkülönböztethető, egyszerűen a megvilágítási hullámhossz , az objektív kimenetén lévő törésmutató és a fele felhasználásával fejezhető ki. a maximálisan elérhető fénykúp szöge .
ahol NA a lencse szorzata vagy numerikus nyílása . Ezért kétféleképpen növelhetjük a felbontást:
A hagyományos fénymikroszkóp felbontási határa körülbelül 0,2 μm . A transzmissziós elektronmikroszkóp eléri a százszor kisebb határt.
Javított felbontás az optikai mikroszkóppalSzámos fénymikroszkópos technika lehetővé teszi a felbontás növelését. Amikor túllépik az Abbe határértéket, „szuperfelbontásnak” vagy nanoszkópiának nevezik őket. Ide tartoznak többek között:
Ha hagyományos mikroszkópot használunk, akkor azt transzmisszióban használjuk, vagyis a fény áthalad a megfigyelt mintán. Dolgozni "reflexióban" is lehet. Ebben az esetben a mintát a megfigyelővel ugyanarról az oldalról világítják meg, akár felülről, egyenes mikroszkóp céljából, akár alulról, inverz mikroszkópok esetében, amelyeket metallográfiában vagy kristálytanban használnak. A forrás által előállított fény először átmegy az objektíven, megérkezik a mintába, visszaverődik és újra áthalad a megfigyelés célján, amelyhez több tükrös vagy prizmás készlet szükséges.
A reflexiós mikroszkópia átlátszatlan vagy túl vastag objektumokat vizsgál át. Cserébe természetesen csak fehér fényben történő megfigyelés esetén adhat információt a minta felületéről; polarizált fényben lehetővé teszi az ásványi anyagok vagy fémek alkotóelemeinek szemcsés orientációjának feltárását.
Klasszikus eset a metallográfia, amikor ilyen módon metallográfiának nevezett fémrészeket figyelünk meg . Mint fentebb említettük, a mikroszkópot gyakran megfordítják, a megfigyelendő részt a tartólemezre helyezik (általában kör alakú lyukkal átszúrva).
A diaszkópos megvilágítással ( dia- through) ellentétben az episzkópos megvilágítás ( epi- on) lehetővé teszi az átlátszatlan színű tárgyak megfigyelését és "természetesebb" megjelenítést biztosít számukra.
Az ilyen világítás gondolata régi, mivel 1740- ben Descartes inspirálta Lieberkühnt, aki mikroszkóp alatt megfigyelései céljából létrehozott egy ezüst tükört, amely körülvette az objektívet, ennek a tükörnek a középpontjában az előkészítés áll.
A fénymező (vagy „fényes mező”) optikai mikroszkópia a legegyszerűbb és a legrégebbi a mikroszkópos technikák közül. Az alkalmazott hullámhosszak (látható spektrum) a mikroszkóp felbontóképességét 0,2 µm-re korlátozzák azok számára, akik a legjobb optikával rendelkeznek.
A megvilágítás fehér fény átadásával történik, vagyis a mintát alulról világítják meg, és felülről figyelik meg. Ennek a technikának a korlátai főleg a legtöbb biológiai minta alacsony kontrasztja és alacsony felbontás a fókuszsíkon kívüli anyag által létrehozott elmosódás miatt. Másrészt a technika egyszerű, és a minta csak minimális előkészítést igényel.
Ha a mintát felülről világítják meg, akkor azt mondják, hogy a mikroszkóp „invertált mikroszkóp”. Az objektív ekkor az előkészítés alatt helyezkedik el, és az okulárcső kiegyenesíti a fénysugarakat úgy, hogy az okulárok „normálisan” legyenek elhelyezve a felhasználó számára.
A sötét mező mikroszkóp, amely a "sötét mező mikroszkópia" elvét használja, javítja az átlátszó, de nem festett minták kontrasztját.
A sötét mező megvilágítása gondosan összehangolt fényforrást használ a közvetlenül átvitt fény mennyiségének minimalizálása érdekében, és csak a minta által szórt fényt gyűjti össze. Drámai módon növelheti a kontrasztot, különösen az átlátszó minták esetében, miközben kevés felszerelést és egyszerű minta-előkészítést igényel. Ez a technika azonban alacsony összegyűjtött fényintenzitástól szenved, és még mindig befolyásolja a felbontási határ.
A Rheinberg megvilágítás a sötét megvilágítás egyik változata, ahol átlátszó színszűrőket helyeznek be közvetlenül a kondenzátor elé, így a többé-kevésbé ferde fénysugarak másképp színezhetők (a kép alja kék lehet, míg a minta élénk sárga színűnek tűnik). A felbontási határ megegyezik a sötét mezõvel. Más színkombinációk is lehetségesek, de hatékonyságuk meglehetősen változó.
A sötét mező mikroszkópia különösen alkalmas friss mintákra, és lehetővé teszi a mikrocinematográfiát (pl. Mozgásban lévő baktériumok). Nem érdekli a színes tárgyak (kenet vagy színes szakaszok). Különösen hasznos:
A ferde megvilágítás használata (oldalról) háromdimenziós képet ad, és kiemelheti az egyébként láthatatlan szempontokat. Ez a fő előny. A korlátozások megegyeznek a fényes mező mikroszkóppal.
Polarizált fénymikroszkópiában a mintát egy polarizátor és egy analizátor közé helyezzük annak érdekében, hogy kimutassuk a fény polarizációjának változásait, miután áthaladtunk rajta. Ez a technika nagyon hasznos a kettős törésű közegek megfigyelésére , különösen az ásványtanban.
Amikor bizonyos vegyületeket nagy energiájú fényforrás világít meg, akkor alacsonyabb energiával bocsátanak ki fényt. Ez a fluoreszcencia jelensége . A fluoreszcencia (vagy epifluoreszcencia ) mikroszkópia egy olyan optikai mikroszkópot alkalmazó technika, amely precíz hullámhosszú foton sugárzás lézersugárzójával van felszerelve. Ez a sugárzás fluoreszcens tulajdonságokkal rendelkező célmolekulát gerjeszt. Lehetővé teszi a fluoreszcencia és a foszforeszcencia jelenségének kihasználását a klasszikus megfigyelés helyett vagy kiegészítve a természetes vagy mesterséges látható fény visszaverődésével (fizikai) vagy abszorpciójával.
Ez a módszer ma elsődleges fontosságú az élettudományokban, különösen a sejt- vagy szövetszerkezetek fluoreszcens molekulákkal, például rodaminnal vagy fluoreszceinnel történő címkézésének köszönhetően . Nagyon érzékeny lehet, még az izolált molekulák kimutatását is lehetővé teszi. Különböző szerkezetek vagy kémiai vegyületek egyidejűleg is kimutathatók különböző vegyületek alkalmazásával, amelyeket megkülönböztetnek fluoreszcencia színük.
A teljes belső reflexiós fluoreszcencia mikroszkóp ( TIRF , teljes belső reflexiós fluoreszcencia mikroszkóp ) vagy mikroszkopikus evanescent hullám egy bizonyos típusú optikai fluoreszcens mikroszkóp , amely egy minta nagyon vékony (200 nm-nél kisebb vastagságú) szeletét vizsgálja egy adott megvilágítási mód: teljes belső visszaverődés .
A fáziskontraszt egy széles körben alkalmazott technika, amely a törésmutatók különbségeit hangsúlyozza a kontraszt különbségeként. Frederik Zernike holland fizikus dolgozta ki az 1930-as években (ezért 1953-ban Nobel-díjat kapott). Például egy sejt magja sötétnek tűnik a környező citoplazmában. A kontraszt kiváló, azonban ez a technika nem használható vastag tárgyakkal. Gyakran halo képződik apró tárgyak körül, amelyek elnyomhatják a részleteket.
A rendszer a kondenzátorban lévő körgyűrűből áll, amely fénykúpot eredményez. Ez a kúp a lencse hasonló méretű gyűrűjére kerül. Minden objektívnek különféle méretű gyűrűje van, ezért a kondenzátort minden objektívváltozáshoz hozzá kell igazítani. A lencsében lévő gyűrű különleges optikai tulajdonságokkal rendelkezik: csökkenti a közvetlen fény intenzitását, és ami még fontosabb, negyed hullámhosszúságú mesterséges fáziskülönbséget hoz létre, amely interferenciát eredményez a szórt fényben, és amely létrehozza a kép kontrasztját.
Az interferencia kontraszt (IC, IC az angolul beszélők számára) egy olyan technika, amely lehetővé teszi az átlátszó objektumok megtekintését kontrasztjuk növelésével. A Nomarski szerint jelenleg az 1950-es években feltalált CI a legelterjedtebb. Ez a technika a fáziskontraszthoz képest fontosabb lehetőséget nyújt azáltal, hogy kiküszöböli az utóbbira jellemző halo jelenséget. A mikroszkópiában ma számos területen bevált.
A konfokális mikroszkóp teljesen más módon generál képet, mint a normál fénymező mikroszkópia. A felbontás valamivel jobb, de a legfontosabb az, hogy lehetővé teszi a keresztmetszetek képének kialakítását anélkül, hogy a fókuszsíkon kívüli fény megzavarná őket. Ezért nagyon világos képet ad a háromdimenziós tárgyakról. A konfokális mikroszkópot gyakran használják fluoreszcens mikroszkóppal együtt.
A lensless mikroszkóp rögzíti a diffrakciós mintázat egy lézer a minta (elve holográfia ), majd feldolgozza ezt mintát a számítógépnek a képet.
A megfigyelt mintának meg kell felelnie bizonyos feltételeknek:
A biológiában először el kell helyezni a szövet (vagy az élő szervezeteket tartalmazó folyadék) metszetét egy tárgylemez és egy fedőlemez között . A célnak megközelítenie kell a pengét a fókuszáláshoz, anélkül, hogy ügyetlenséggel tönkretenné a nagyon törékennyé vált készítményt.
Az előkészítés miatt az optikai mikroszkópia nagyszámú kiegészítő eszközt igényel, kizárólag a mikroszkópos megfigyelés céljából.
Vegyük a biopszia esetét az orvostudományban és a biológiában ( anatomopatológia ): a műtét során biopsziával felvett biológiai részek mikroszkópos diagnosztizálása rövid határidőket szab meg. A tárgylemez előkészítéséhez kriotomát , egyfajta " sonkaszeletelőt " használunk , egy kriosztátba (fagyasztóba) helyezve , amely lehetővé teszi a test nagyon vékony szeleteinek vágását, amelyek gyors lehűtéssel, majd vágással lesznek megfigyelhetők. egy speciális borotva pengéjével, amelyet egy másik üveglemez-gépen éleztek meg gyémántpaszták segítségével. Ha szobahőmérsékleten akarunk dolgozni, az idő hosszabb, és dehidratálást, valamint paraffinnal eltávolított víz pótlását igénylik (24 óra), hogy a minta megtartsa merevségét; akkor számos, váltakozó hatású, nagyon hosszú ideig tartó anyag is színesíti.